Reinkulturen herstellen
Pilze Klonen
Benötigtes Material
- Ein Skalpell mit neuer, scharfer Klinge
- Einwegmaske, Einweghandschuhe, Desinfektionsmittel (70% Ethanol oder 70% Isopropanol)
- Optional eine Präparierschere und/oder -pinzette
- Sterile Nährböden – Malzagar für die meisten Saprobionten, Kartoffel-Dextrose-Agar für Streuzersetzer
- Parafilm zum Verschliessen der Petrischalen
- Permanent Marker für die Beschriftung der Petrischalen – es empfiehlt sich einen Marker zu wählen, welcher auch mit Lösungsmittel permanent ist, damit wir später die Petrischale desinfizieren können, ohne dass die Bezeichnung danach neu angebracht werden muss. Geeignet sind z.B. die Edding Marker N°780
- Frische Pilzfruchtkörper
- Reinluftbank, Glove-Box, Bunsenbrenner oder ähnliche Einrichtung zum sterilen Arbeiten
Vorgehen
Das Klonen ist eine der einfachsten Methoden, um eine Reinkultur eines Pilzes zu erhalten, mit der später in der Produktion gearbeitet werden kann.
Wenn wir einen stattlichen Pilzfruchtkörper haben, kann dieser rundum mit Desinfektionsmittel besprüht werden, um fremde Organismen und Keime zu reduzieren. Wenn der Fruchtkörper zierlich und klein ist, wie der eines Samtfussrüblings, sollte die Desinfektion nur sparsam erfolgen, da es auch etwas in den Fruchtkörper eindringt und die Pilzzellen schädigt.
Jetzt wird der Pilz vor dem Laminar Flow aufgebrochen, um an das sterile Innengewebe zu gelangen. Aus diesem wird mit einem sterilen Skalpell ein kleines Gewebestück entnommen und auf den Nährboden übertragen.
Während der Arbeit sollte die Petrischale so kurz wie möglich geöffnet bleiben, und es sollten nur sterile Arbeitsgeräte über der offenen Schale verwendet werden. Dadurch lässt sich das Risiko von Kontaminationen deutlich reduzieren.
Nach dem Transfer wird die Petrischale mit Parafilm versiegelt. Abschliessend wird sie mit einem Permanentmarker mit den wichtigsten Angaben (z. B. Pilzart, Datum und Probe) beschriftet.
Kultur mithilfe von Sporen herstellen
Benötigtes Material
- Pilzfruchtkörper
- Alufolie
- Schüssel
- Zwei sterile oder desinfizierte, trockene Wattestäbchen
- 5 Proberöhrchen mit je 10 ml Volumen (z. B. Zentrifugenröhrchen mit Standboden)
- Eine sterile oder desinfizierte Spritze mit Nadel und ml-Skala (Volumen mindestens 10 ml)
- Abgekochtes, destilliertes Wasser, etwa 1 dl
- Sterile Nährböden (MYA oder PDA)
- Parafilm
Schritt 1 – Einführung
Um eine Reinkultur aus Sporen zu erhalten, muss zunächst ein Sporenabdruck hergestellt werden.
Dafür benötigt man einen reifen Pilzfruchtkörper, ein Stück Aluminiumfolie oder eine glatte, saubere Oberfläche sowie eine Schüssel.
Der Pilz wird mit den Sporenträgern nach unten auf die Alufolie gelegt (Sporenträger = Lamellen, Röhren, Poren, Leisten etc.) und mit der Schüssel abgedeckt. Bei den meisten Pilzen reicht eine Wartezeit von wenigen Stunden, damit genügend reife Sporen freigesetzt werden. Wenn der Pilz eher langsam absport, kann er auch über Nacht unter der Schüssel bleiben.
Mit dem entstandenen Sporenabdruck kann anschliessend versucht werden, eine Reinkultur auf Nährboden herzustellen.
Schritt 2 – Vorbereitung der Sporenlösung
Zuerst wird mit der Spritze ein Proberöhrchen mit 10 ml abgekochtem Wasser gefüllt. Die vier übrigen Röhrchen werden jeweils mit 9 ml Wasser befüllt.
Anschliessend wird mit einem Wattestäbchen etwas Material vom Sporenabdruck aufgenommen. Dabei gilt oft: Weniger ist mehr. Ein Wisch von etwa 1 cm Länge enthält in der Regel bereits genügend Sporen.
Das Wattestäbchen wird danach in das erste Proberöhrchen mit 10 ml Wasser gegeben. Durch kräftiges Rühren mit dem Wattestäbchen werden die Sporen in das Wasser überführt.
Schritt 3 – Verdünnungsreihe
Von der vorbereiteten Sporenlösung werden zunächst 1 ml entnommen und in ein Proberöhrchen mit 9 ml Wasser gegeben. Das Röhrchen wird verschlossen und gut geschüttelt, damit sich die Sporen gleichmässig verteilen.
Anschliessend wird aus diesem Röhrchen erneut 1 ml entnommen und in das nächste Röhrchen mit 9 ml Wasser überführt. Dieser Schritt wird bis zum fünften Röhrchen wiederholt. Auf diese Weise entsteht eine Verdünnungsreihe mit abnehmender Sporenkonzentration.
Die resultierenden Konzentrationen sind:
100 % – erstes Röhrchen
10 % – zweites Röhrchen
1 % – drittes Röhrchen
0,1 % – viertes Röhrchen
0,01 % – fünftes Röhrchen
Nun wird das zweite Wattestäbchen verwendet, um die verschiedenen Sporenlösungen auf die Nährböden aufzutragen. Für jede Konzentration wird eine Petrischale verwendet.
Es wird mit der stärksten Verdünnung (0,01 %) begonnen und mit der unverdünnten Sporenlösung (100 %) abgeschlossen. Dadurch kann das gleiche Wattestäbchen verwendet werden, ohne die Verdünnungsreihe zu verfälschen.
Die Petrischalen werden anschliessend mit Parafilm verschlossen und bei etwa 24 °C inkubiert (warmgestellt), bis die Sporen keimen.
Mit der beschriebenen Methode lässt sich feststellen, welche Verdünnung der Sporenlösung am besten geeignet ist. Mit dieser Verdünnung können anschliessend weitere Nährböden beimpft werden.
Idealerweise möchten wir auf einer Petrischale etwa zehn keimende Sporen erhalten. Diese Anzahl bietet eine gute Übersicht, sodass Kontaminationen leicht erkannt werden können und die die gekeimten Sporen bei Bedarf isoliert werden können.
Sobald alle Kontaminationen entfernt wurden, kann das Myzel weiter wachsen. Treffen kompatible Myzelien aufeinander, können sie sich paaren und zu einem stabilen Myzel entwickeln. Auf diese Weise erhalten wir schliesslich eine Reinkultur eines neuen Pilzindividuums.
Alternative Methode: Z-Ausstrich
Eine andere Methode, die ohne eine Verdünnungsreihe auskommt, wird häufig in der Mikrobiologie beim Arbeiten mit Bakterien und Hefen eingesetzt und eignet sich auch für Pilzsporen.
Für diese Methode werden benötigt:
die unverdünnte Sporenlösung (100 %)
ein Nährboden
drei sterile Wattestäbchen
Mit dem ersten Wattestäbchen wird etwas Sporenlösung aufgenommen und am Rand der Petrischale in Form eines „Z“ ausgestrichen.
Mit einem zweiten, sauberen Wattestäbchen wird erneut ein „Z“ gezeichnet, wobei der Anfang des zweiten Ausstrichs den ersten Ausstrich einmal kreuzt. Dasselbe Verfahren wird anschliessend mit einem dritten Wattestäbchen wiederholt.
Wichtig ist dabei, dass die vorherigen Ausstriche jeweils nur am Anfang gekreuzt werden und nicht entlang der gesamten Linie. Dadurch nimmt die Sporendichte entlang der Ausstriche zunehmend ab, sodass sich auf kurzer Strecke ein Bereich mit einer geeigneten Verteilung einzelner Sporen bildet.
Der Vorteil dieser Methode liegt im geringeren Material- und Zeitaufwand. Der Nachteil besteht jedoch darin, dass bei Verwendung der unverdünnten Sporenlösung Kontaminationen schneller den Nährboden besiedeln können, bevor der Bereich mit idealer Sporendichte erkannt und isoliert wird.